2020版《中國藥典》 | 睿科中藥材中黃曲霉毒素測定的解決方案
1.介紹
黃曲霉毒素（Aflatoxins, AF）是一類由黃曲霉和寄生曲霉產生的代謝產物，具有誘發人體致畸、致癌、致突變的作用，主要的污染物有黃曲霉毒素B1, B2, G1, G2。中藥材大多以天然植物為基源，在儲存不當或因其他外界條件影響時，易受霉菌污染產生黃曲霉毒素。因此對中藥材進行黃曲霉毒素的高效便捷檢測是十分有必要的。
參考2020年版《中國藥典》四部通則中《2351 真菌毒素測定法 黃曲霉毒素測定法》第一法，試樣經過70%甲醇水提取，提取液經稀釋、離心后，使用Raykol Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀，濾液自動化經過含有黃曲霉素特異抗體的免疫親和柱凈化和富集后，目標化合物通過帶有三重四級桿質譜檢測器的高效液相色譜儀進行測定，建立了中藥材中黃曲霉毒素高靈敏度的前處理和分析方法，并進行三種常見中藥材（陳皮、人參、當歸）中黃曲霉毒素的加標回收驗證，平均回收率在84.5~101.3%之間，RSD小于10%。
2.儀器、耗材
儀器
Raykol Fotector Plus 高通量全自動固相萃取儀
Raykol Auto EVA-60 全自動平行濃縮儀
Raykol AH-30 全自動均質器
Raykol Auto Prep 200 全自動液體樣品處理工作站
高效液相色譜（HPLC）：Agilent 1200
質譜檢測器 (MS)：Agilent 6430
耗材
黃曲霉毒素免疫親和柱
試劑
緩沖液：稱取25 g氯化鈉、5 g碳酸氫鈉溶于水中，加入0.1 mL吐溫-20，用水稀釋至1000 mL即得淋洗緩沖液。
使用Auto Prep 200全自動液體樣品處理工作站配制黃曲霉毒素混合標準工作液，具體配制方法如圖-1所示：
空白基質溶液用Auto EVA -60全自動平行濃縮儀氮吹后，分別加入1 mL上述混合標準工作溶液復溶，過0.22 μm的有機相濾膜后配制成基質混合工作溶液，供液相色譜-質譜聯用儀測定。
3.樣品提取與前處理
陳皮、人參、當歸試樣前處理
準確稱取15 g試樣于120 mL離心管中，加入3 g氯化鈉及75 mL甲醇-水溶液（7:3，V/V），12000轉/分鐘攪拌速度下均質2 min，離心5 min（轉速4000 r/min）。準確量取15 mL上層提取液于50 mL容量瓶中，用水定容、取30 mL至50 mL離心管中, 離心10 min（轉速4000 r/min），最后準確移取20 mL上清液至80 mL玻璃上樣管，待凈化用。
固相萃取凈化條件
凈化方法
凈化過程采用黃曲霉毒素免疫親和柱進行富集凈化，具體方法如下：
清洗樣品通道：用甲醇清洗；
上樣：采用2 mL/min的流速進行精確上樣20 mL；
淋洗：采用緩沖液和純水進行淋洗小柱；
氣推：用60 mL空氣將水擠出免疫親和柱；
洗脫：以0.5 mL/min的速度用甲醇進行洗脫，開始收集溶液；
氣推：將柱子里溶液用空氣推出，收集溶液。
將收集液用甲醇定容至2 mL，混勻后過0.22 μm濾膜用液質檢測。詳細步驟見圖-2。
圖-2 Fotector Plus黃曲霉毒素的免疫親和凈化方法
4.液質聯用色譜圖
4種黃曲霉毒素標準溶液的MRM色譜圖
5.樣品測試
基質標準工作曲線
選擇定量離子的峰面積作為縱坐標，濃度作為橫坐標，做相關曲線，曲線為線性回歸，各點權重相等，擬合出工作曲線，要求R2>0.99。
基質加標回收實驗
在陳皮、人參、當歸3種常見樣品基質中添加水平為1.8 μg/kg的黃曲霉毒素G2、B2和6.0 μg/kg的黃曲霉毒素G1、B1進行加標回收驗證，平均回收率和RSD結果見下表：
表-1 平均回收率和相對標準偏差 (n=4)
6.總結
A.提取液需加入水進行稀釋、定容至50 mL后才可進行凈化，以防止過多的有機溶劑使免疫親和柱失活。
B.在人參和當歸的凈化過程中，如采用20 mL水作為淋洗液，其加標回收率為70~80%；而將10 mL的緩沖液和10 mL的純水作為淋洗液時，可除去免疫親和柱上殘留的色素和基質，從而提高回收率。
C.進行洗脫時甲醇的過柱流速控制在1滴/s為宜。洗脫效果不佳時，可采取讓甲醇浸泡免疫親和柱后再加以洗脫。
D.由于黃曲霉毒素在紫外光照射下不穩定，因此在實驗過程中應避免紫外光和太陽光的照射。
7.解決方案優勢
通過高通量全自動固相萃取儀進行凈化和富集，能自動化進行免疫親和柱自動脫帽和樣品上樣、淋洗和洗脫等過程，8種溶劑可選，6個樣品通道同時運行，能連續、批量處理多樣品，實現高通量、自動化固相萃取過程。
整體解決方案可實現樣品快速高效處理，提高工作效率。同時自動化前處理解決方案可解放實驗人員雙手，也避免有機溶劑的毒害。
配液
睿科 全自動液體樣品處理工作站
提取
睿科 全自動均質器
濃縮
睿科 全自動平行濃縮儀
凈化富集
睿科 高通量全自動固相萃取儀
